江南大學(xué)生物工程學(xué)院院長劉龍教授在營養(yǎng)健康食品產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展高峰論壇上發(fā)布了“構(gòu)建細(xì)胞工廠高效合成嬰配奶粉關(guān)鍵功能營養(yǎng)因子”的主題報告。

劉龍教授對嬰幼兒配方奶粉的定義及其關(guān)鍵功能營養(yǎng)因子簡單介紹后，重點(diǎn)闡述了通過構(gòu)建細(xì)胞工廠高效合成嬰配奶粉關(guān)鍵功能營養(yǎng)因子的最新研究進(jìn)展。01背景介紹

嬰幼兒配方奶粉是以牛乳/大豆等為主要原料，加入適量的脂質(zhì)、寡糖和其他輔料，調(diào)節(jié)成分模擬母乳加工而成的嬰幼兒配方食品。

母乳中的主要營養(yǎng)成分有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)以及其他各種生物活性物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)中的乳鐵蛋白（LF），脂質(zhì)中的甘油三酯（TAG）以及碳水化合物中的母乳寡糖可通過細(xì)胞工廠進(jìn)行高效生產(chǎn)。

微生物細(xì)胞工廠是指利用微生物強(qiáng)大的生物轉(zhuǎn)化或合成能力，基于合成生物學(xué)等技術(shù)開發(fā)構(gòu)筑的能夠進(jìn)行物質(zhì)生產(chǎn)的人工代謝體系。02研究成果01乳鐵蛋白細(xì)胞工程的構(gòu)建

乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)是一種非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，在體內(nèi)行使轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子的作用；LF也是母乳中的核心免疫蛋白，是嬰幼兒成長發(fā)育中不可或缺的重要營養(yǎng)。

將乳鐵蛋白(LF)編碼基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，并通過表達(dá)分子伴侶與促溶標(biāo)簽輔助蛋白折疊，LF搖瓶中產(chǎn)量達(dá)到537 μg/L，通過研究發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基中，說明蛋白分泌是主要限制因素。

通過信號肽篩選、雜合信號肽構(gòu)建、核糖體蛋白強(qiáng)化、轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)等的優(yōu)化后，LF搖瓶中產(chǎn)量達(dá)到654.5 mg/L。

在3-L發(fā)酵罐中對甲醇誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化調(diào)控，LF產(chǎn)量達(dá)到5.38 g/L；并且對純化后的LF進(jìn)行生理活性檢測，當(dāng)LF濃度達(dá)到10 mg/L時抑菌率為35%，且未對動物細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生影響。02母乳脂質(zhì)細(xì)胞工廠的構(gòu)建

母乳脂質(zhì)(98%-99%為甘油三酯，TAG)是母乳中的第二大固體成分，其中約70%的棕櫚酸位于Sn-2位，不飽和脂肪酸位于Sn-1,3位(如OPO與OPL)。

在釀酒酵母中通過脂質(zhì)合成強(qiáng)化、TAG合成途徑重構(gòu)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)調(diào)控等策略，TAG含量提升9.4倍且OPO占總TAG的比例由0%提升至1.9%。進(jìn)一步通過脂肪酸合成酶系改造、?；w比例優(yōu)化及關(guān)鍵基因表達(dá)強(qiáng)化等策略，OPO占總TAG的比例由1.9%提升至12.9%(產(chǎn)量為1.9 mg/g DCW)。

03母乳寡糖（HMOs）細(xì)胞工廠的構(gòu)建

母乳寡糖(HMOs)是母乳中僅次于乳糖和脂質(zhì)的第三大固體成分，主要分為巖藻糖基化HMOs、乙?；疕MOs和唾液酸化HMOs三類，具有支持免疫系統(tǒng)、消化健康及大腦發(fā)育等功能。

劉龍教授團(tuán)隊利用底物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)優(yōu)化、動態(tài)調(diào)控等合成生物學(xué)技術(shù)，能夠創(chuàng)制可從頭合成2＇-FL、LNnT、LNT、3′-SL、6′-SL和3-FL的系列HMOs細(xì)胞工廠。

其中對巖藻糖基化HMOs-2′-FL細(xì)胞工廠的構(gòu)建研究時間較長，研究比較深入。

A、巖藻糖基化HMOs：2′-FL細(xì)胞工廠的構(gòu)建 

以大腸桿菌(E. coli)MG1655菌株為底盤細(xì)胞，通過合成途徑優(yōu)化重構(gòu)、關(guān)鍵酶的穩(wěn)定性表達(dá)以及輔因子供應(yīng)體系優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖和乳糖為底物的2′-FL高效從頭合成，3-L發(fā)酵罐中的產(chǎn)量與乳糖轉(zhuǎn)化率分別為57.4 g/L與0.79 mol/mol

劉龍教授團(tuán)隊對2′-FL的細(xì)胞工廠構(gòu)建研究中，一步一個腳印，逐步深入研究，最終達(dá)到的成果是3-L發(fā)酵罐中2′-FL的產(chǎn)量與乳糖轉(zhuǎn)化率分別為88.3 g/L與0.61 g/g。

B、巖藻糖基化HMOs：3-FL細(xì)胞工廠的構(gòu)建 

在E. coli中，通過從頭合成途徑重構(gòu)、糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)優(yōu)化與分子改造、基于無膜細(xì)胞器的途徑酶組裝等策略，3-FL的搖瓶產(chǎn)量達(dá)到13.5 g/L。

C、巖藻糖基化HMOs：LNnT細(xì)胞工廠的構(gòu)建

以B. subtilis 168為底盤細(xì)胞，通過異源途徑的組裝適配以及關(guān)鍵基因的表達(dá)優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖和乳糖為底物的LNnT從頭合成，產(chǎn)量為1.31 g/L 基于dCas9創(chuàng)制了木糖誘導(dǎo)型的CRISPRi系統(tǒng)，對LNnT合成的競爭途徑進(jìn)行動態(tài)組合弱化，LNnT搖瓶產(chǎn)量提升至2.30 g/L，3-L發(fā)酵罐上產(chǎn)量達(dá)到5.4 g/L。

D、唾液酸化HMOs：3′-SL細(xì)胞工廠的構(gòu)建 

通過系統(tǒng)的表征、設(shè)計與優(yōu)化，獲得代謝途徑精細(xì)調(diào)控工具-N端編碼序列(NCS)，并利用該工具在B. subtilis中實(shí)現(xiàn)了3′-SL前體唾液酸的從頭合成。經(jīng)過一系列優(yōu)化，最終3′-SL產(chǎn)量達(dá)到1252.1 mg/L。

劉龍教授團(tuán)隊利用合成生物學(xué)技術(shù)設(shè)計構(gòu)筑了系列細(xì)胞工廠，從而實(shí)現(xiàn)了乳鐵蛋白、母乳脂質(zhì)、HMOs等嬰配奶粉關(guān)鍵功能營養(yǎng)因子的高效合成、中試或工業(yè)化生產(chǎn)。

劉龍教授詳細(xì)地介紹了他們團(tuán)隊在構(gòu)建細(xì)胞工程高效合成嬰配奶粉關(guān)鍵功能營養(yǎng)因子的研究工作，為進(jìn)一步促進(jìn)嬰配奶粉行業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展具有重要意義。